大多数肽的合成是通过采用Fmoc或Boc保护方法的固相肽合成来实现的，然而在使用Fmoc-OSu时，由于二肽（或三肽）和β-丙氨酰胺杂质的形成，在氨基酸中未受保护的N引入Fmoc似乎具有挑战性。在此介绍一种基于肟的衍生物Fmoc-Amox合成Fmoc-Gly-OH的有效方法，且没有任何副反应。Fmoc-Amox价格低廉，并且Amox在反应后可以很容易地去除，从而提供不含任何有害杂质或污染物（主要是二肽或Amox本身）的纯Fmoc-Gly-OH，这一点可以从高效液相色谱和核磁共振得到论证。

1963年，Merrifield描述了一种全新的化学合成概念，市场上有一些药物的活性成分(API)是TIDES（寡核苷酸和肽治疗剂），含有多达30-40个单体，这些单体是使用Merrifield首次描述的固相方法生产的。虽然一开始固相肽合成（SPPS）方法在某种程度上受到了他欧洲同事的质疑，但目前此方法已经广泛应用于合成研究及生产。

从命名可以看出，所有氨基酸至少有两个官能团：一个羧酸和一个氨基。如果氨基酸C末端羧酸的活性被不溶性高分子基团掩盖、氨基被临时保护起来，再逐步连续的参与反应，也包括脱除氨基的保护基团，然后与下一个N被保护的氨基酸进行偶联。然而，在三官能团氨基酸的情况下，侧链则被永久（或半永久）保护基团所保护。早些年，Merrifield使用苄基 (Bn) 进行长期保护，使用叔丁氧基羰基 (Boc)作为临时保护基团，但是Boc和Bn都可以在酸性条件下分解：三氟乙酸（TFA）脱Boc、强酸如HF或三氟甲磺酸（TFMSA）水解Bn。在70年代，同样提出过Boc保护基团的Carpino，通过提出芴基甲氧羰基(Fmoc)作为临时保护氨基的基团，彻底改变了肽化学领域，即可以使用碱脱除N保护基团，因而与Boc基团正交。此外，欧洲的Sheppard和Atherton，与美国的Chang和 Meienhofer同时开发了Fmoc/t-Bu方法，反应用TFA溶液处理后释放出肽。该方法的实施标志着肽合成的“平民化”，因为Boc/Bn方法的使用需要训练有素的化学工作者和特殊设备，而通过Fmoc/t-Bu方法，其他生物学实验室也能够合成肽。此外，该方法已实现了生产公斤级肽。

最初商业化的Fmoc-氨基酸是用Schotten-Baumann方法合成：氨基酸与Fmoc-Cl在碱性条件下反应（图1A）。80年代早期，Ashish小组和Bachem、Goodman指出了大多数商业化Fmoc-氨基酸中包含二肽和三肽，这些杂质来自Fmoc-Cl的高反应性，它也可以与要保护的氨基酸的羧基反应生成酸酐，酸酐又可以与另一个氨基酸分子的胺末端反应，导致形成二肽。机制如图1B所示。

图1  氨基酸的Fmoc保护
A. Fmoc保护机制
B. 在氨基酸保护过程中形成受保护二肽的机制

考虑到即使是很小比例的杂质也会导致收率和纯度下降，因此双方共同得出了避免使用 Fmoc-Cl的结论。由于这些副反应与离去基团的质量有关，Ashish小组建议使用Fmoc-N3，同样Carpino 和Han在他们的论文中也有提到此观点。Ashish小组提出了用Fmoc-Cl和叠氮化钠合成Fmoc-N3，为了避免Fmoc-N3制备和存储的危险性，现做现用，该方法合成的Fmoc-氨基酸具有较高纯度。Verlander等人通过筛选不同的离去基团，建议使用Fmoc-OSU，与此同时，Bolin等人建议使用甲硅烷基化试剂保护羧基。多年后，Barlos等人提出了从Trt-Cl制备Trt-氨基酸的方法，以避免Trt酯类杂质的生成。后来，Suresh等人提出在活化锌粉存在下用Fmoc-Cl制备Fmoc-氨基酸，此方法允许在中性条件下进行。

然而，长期以来最常用的Fmoc-氨基酸合成方法是Fmoc-OSu（或 NHS），当Hlebowicz等人对Fmoc-Cl制备Fmoc-氨基酸提出质疑时，该方法也受到了质疑。Bachem Europe的研究表明，使用Fmoc-OSu制备的Fmoc-AA-OH中含有Fmoc-β-Ala-OH和Fmoc-β-Ala-AA-OH，这两个杂质是在OSu攻击一个羰基后通过Lossen重排形成的（图2）。

图2  β-丙氨酰胺通过Lossen重排的形成机制

这些发现再次激发了开发新试剂或安全引入Fmoc基团方法的研究热情。表1列出了用于保护氨基酸的不同Fmoc衍生物及其用于制备Fmoc-Gly-OH的结果，虽然这种反应可以用于所有氨基酸的保护，但Gly更明显，因为它的低位阻有利于高效率的聚合。这些引入Fmoc的衍生物应具有两个关键特征：（i）无特殊高反应性，避免低聚肽的形成；（ii）离去基团通常是被氨基酸取代的羟基化合物，在处理过程中相对更容易去除。因此，Ashish小组首先提出了 Fmoc-2-巯基苯并咪唑，它合成的Fmoc衍生物中低聚肽较少（表1，#4）。然而，反应中释放的副产物2-MBT溶解度差，需要用有机溶剂洗涤才能完全去除，而Fmoc-氨基酸在有机溶剂中也有一定的溶解度，因此不利于最终产率。Verlander等人遇到了类似的问题，当使用（多）氯苯基衍生物时，有机溶剂醇污染了最终产品，导致总收率低（4-30%）。

其他琥珀酰亚胺的衍生物，例如邻苯二甲酰亚胺、降冰片烯基（它是由降冰片烯衍生的自由基）和相应的螺环类似物、六元衍生物等，也进行了分析，但并不具有显著优势（表1，#5-7）。同时，当降冰片烯基与EDC结合用于水中的固相肽合成 (SPPS) 时，检测到了β-丙氨酸的形成。为了克服使用琥珀酰亚胺衍生物导致β-丙氨酰胺残基嵌入问题，Najera等人提出了一种聚合物形式的试剂，最终β-丙氨酰胺污染物是固定在聚合物载体上的，但这种方法限制了制备少量保护氨基酸的使用。

通常与碳二亚胺偶联化合物例如五氟苯基(Pfp)或苯并三唑(Bt)一起使用的其他活性物质，虽然这些试剂价格相对偏高(Pfp)或易爆(Bt)（表1、#8、9），但产率很高，有些实验室甚至研究了Fmoc-三嗪衍生物（表1，#10）作为一种合成Fmoc-氨基酸的方法。对于使用纯水溶液引入Fmoc的方法，已使用Fmoc-苯基二甲基锍甲基硫酸盐 (Fmoc-ODsp)，但未研究是否有二肽的形成（表1，#11）。

为了克服肽结构单元合成中的最大挑战之一，即在氨基酸保护过程中不希望形成二肽和三肽，已经深入研究了大量Fmoc离去基团的方法。尽管少量试剂有还不错的结果，但基本没有一种有潜力能应用于工业化生产。在此方面，基于常用的碳二亚胺添加剂肟的结构，提出了Fmoc离去基团衍生物Fmoc-Amox。Fmoc-Amox已用于保护极易产生副反应的H-Gly-OH，有很高的收率 (93%) ，并且完全没有Fmoc-二肽形式的副产物产生，这从 HPLC和NMR分析中得到印证。此外，Amox衍生物将来或许可用于引入其他保护基团，例如pNZ、Alloc和Boc。

Ashish小组认为Oxyma是比碳二亚胺更优秀的添加剂，Oxyma反应性强，在肽的工业化生产中的应用越来越广泛。小组也研究了其他反应性较低的肟衍生物来引入Fmoc基团，从第一次筛选（表1，#12-16）中，包括2-羟基吡啶N-氧化物(HOPO)，Oxyma衍生物（表1，#12）由于其高反应性而得到含量较多的二肽，然后是HOPO（表1，#16）。氰基吡啶肟也是较好的添加剂（表1，#15），但其价格昂贵，而且很难从反应中去除。第二次筛选得到的二肽形成量总体较少（表1，#17-20），因此选择氰基酰胺衍生物（Amox）（表1，#20）作为替代 HOSu 以引入Fmoc。Fmoc-Amox价格适宜，并且在反应后可以很容易地去除，这与MBT的情况不同，Amox 在水中的溶解度为0.9 M，这确保了它不会污染最终的Fmoc-氨基酸（表1，#4）。

在Fmoc-二肽形成方面，H-Gly-OH被证明是评估Fmoc-Amox性能的最佳试剂，因为其低空间位阻有利于高比例的寡聚化。使用1克和40克两种平行实验制备Fmoc-Gly-OH结果接近，反应过程描述如下：将Fmoc-Amox的丙酮溶液缓慢加入到搅拌的H-Gly-OH和碳酸钠水溶液中，通过连续分批添加碳酸钠将反应混合物的pH值保持在9-10。通过TLC以及pH稳定性监测反应(pH的降低作为发生反应的标志)。反应完成后(4小时)，除去溶剂，剩余的水层用DCM洗涤，然后加入1N HCl(直到pH＜2)，得到灰白色沉淀，然后过滤沉淀物并使用乙酸乙酯和正己烷(93％)重结晶，HPLC检测Fmoc-Gly-OH的纯度非常好。由于通过固相技术制备的Fmoc-Gly-Gly-OH会与Fmoc-Gly-OH一起被洗脱出来，表明形成的二肽杂质是难去除的，如图 3所示，色谱图中没有观察到二肽的痕迹（图3）。此外，1H NMR 未显示Amox存在任何污染（图4），这清楚地表明Amox在合成Fmoc氨基酸方面有很大的优势。

图3  (A) Fmoc-Gly-OH和一同洗脱的Fmoc-Gly-Gly-OH的HPLC色谱图
(B) Fmoc-Gly-OH的HPLC色谱图

图4  Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比较

在这些结果的推动下，使用上述方法制备了Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Val-OH（各10 g小试）（图5和6）。最终产物的纯度通过HPLC和NMR确认，没有显示二肽的微量形成。还研究了溶剂在后处理过程中的重要性，将所得产物溶解在DCM中并使用蒸馏水萃取，DCM后处理有助于去除微量的Amox，从而产生经NMR证实的纯品（图 7）。

图5  (I)A. Fmoc-Phe-OH与Fmoc-Phe-Phe-OH一同洗脱的HPLC色谱图
B. Fmoc-Phe-OH的 HPLC色谱图
(II) Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比较

图6  (I) A. Fmoc-Val-OH与Fmoc-Val-Val-OH一同洗脱的HPLC色谱图
B. Fmoc-Val-OH的 HPLC色谱图
(II) Fmoc-Val-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比较

图7  使用乙酸乙酯和DCM萃取Fmoc-Phe-OH的后处理比较

这些结果清楚地表明了Fmoc-Amox在合成最容易产生副反应的Fmoc-氨基酸方面具有很大的优越性。

Fmoc-氨基酸的合成实例：

1、将甘氨酸（131.34mmol）、碳酸钠（106mmol）加到纯化水中，滴加Fmoc-Amox（119.4mmol）的丙酮溶液，保证反应液pH始终保持在9-10。待TLC检测Fmoc-Amox反应完全，将反应液浓缩去除丙酮后用二氯甲烷萃取除杂，水相用1N HCl调酸，大量白色固体析出，过滤，滤饼用纯化水洗三遍。收集固体用乙酸乙酯/正己烷重结晶，得到高纯度的Fmoc-甘氨酸。

2、将苯丙氨酸或缬氨酸（33mmol）、碳酸钠（75mmol）加到纯化水中，滴加Fmoc-Amox（30mmol）的丙酮溶液，保证反应液pH始终保持在9-10。待TLC检测Fmoc-Amox反应完全，将反应液浓缩去除丙酮后用二氯甲烷萃取除杂，水相用1N HCl调酸，大量白色固体析出，过滤，滤饼用纯化水洗三遍。收集固体用乙酸乙酯/正己烷重结晶，得到高纯度的Fmoc-苯丙氨酸或Fmoc-缬氨酸。

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